Системы репортерных и селективных маркерных генов растительных клеток

Технологии создания гм-растений

Как уже отмечалось, в практике создания новых или улучшенных сортов сельскохозяйственных растений все большее значение приобретает прямое генетическое воздействие на растительный организм. В результате такого вмешательства получается трансгенный организм, геном которого содержит чужеродный генетический материал [5, 34, 47].

Общая схема создания трансгенных растений представлена на

Схема создания генетически модифицированных растений

Основные этапы этого процесса включают:

1) получение целевых генов, предназначенных для введения в растение, и конструирование кассеты экспрессии;

2) конструирование вектора, несущего целевой ген;

3) трансформацию растительных клеток;

4) регенерацию целого растения из трансформированной клетки;

5) детектирование трансформированных растений среди регенерантов.

Получение целевых генов. На первом этапе необходимо получить ген, который будет вводиться в реципи-ентную клетку растения-хозяина. Для этого существует несколько возможностей.

Если расшифрована нуклеотидная последовательность ДНК и картированы гены донорного организма (т.е. известно, какие фрагменты этой ДНК кодируют те или иные признаки), то нужный ген может быть вырезан специальными ферментами рестриктазами из геномной ДНК донора. Другим способом получения целевого гена является химический или ферментативный синтез нужного фрагмента ДНК. И, наконец, искомую нуклеотидную последовательность можно получить ферментативным синтезом ДНК с матричной РНК — кДНК. Таким образом, в результате реализации того или иного способа получают фрагмент ДНК, несущий ген, кодирующий необходимый признак.

Для того чтобы ген после введения его в организм нового хозяина экспрессировался, т.е. работал, и, как результат этого, в клетке синтезировался соответствующий белок, необходимо снабдить его регуляторными элементами. Регуляторные элементы представляют собой определенные последовательности нуклеотидов, которые позволяют гену функционировать. Обязательными компонентами регуляторных элементов являются:

♦ промотор — участок молекулы ДНК, с которым связывается РНК-полимераза (фермент, катализирующий синтез мРНК), что сопровождается инициацией транскрипции гена;

♦ терминатор — участок молекулы ДНК, определяющий окончание синтеза молекулы мРНК.

В качестве промотора чаще всего используют сильный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Он относится к конститутивным промоторам, т.е. таким, которые работают на протяжении всей жизни растения. Иногда требуются специфические промоторы — такие, которые активны в отдельных клетках, тканях, органах или лишь на определенных стадиях жизни растений. Например, есть промоторы, которые работают только в клубнях картофеля и никогда не будут работать в его листьях. Наконец, существуют индуцибельные промоторы, которые активируются только под воздействием определенных факторов — химических веществ, температуры и др. В зависимости от того, какой ген должен быть перенесен в растение и в какой период он должен экспрессироваться, для создания вектора выбирают тот или иной промотор.

Таким образом, кассета экспрессии представляет собой группу функционально связанных участков ДНК, в состав которой входят промотор, целевой ген и терминатор.

Конструирование вектора. Сама по себе кассета экспрессии не может попасть в клетку-реципиент и интегрироваться (внедриться) в хромосомы растения-хозяина. Для этого нужен вектор — специальная молекула ДНК, которая может проникать в клетки растений и там самореплицироваться, либо встраиваться в ДНК хозяина и реплицироваться вместе с ней.

В качестве вектора обычно используют ДНК вируса или бактериофага, а также плазмиды бактерий (кольцевые молекулы ДНК, несущие небольшое количество генов и присутствующие в бактериальной клетке наряду с хромосомной ДНК). Именно плазмиды чаще всего применяются для трансформации растений.

Первые попытки создания таких векторных систем основывались на использовании 77-плазмиды (от англ. tumor-inducing plasmid) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens — фитопатоген, который инфицирует клетки растений, что приводит к образованию опухоли — корончатого галла, нарушающей нормальный

рост растения . Причем, эта бактерия может поражать только клетки двудольных растений.

Инфицирование растений A. tumefaciens и образование корончатого галла

Образование корончатого галла является результатом трех взаимосвязанных процессов:

1. Проникновение бактерии в клетку растения.

2. Интеграция в геном растительной клетки специфического сегмента плазмидной ДНК бактерии — Т-ДНК (от англ. transferred DNA — часть плазми-ды, индуцирующей развитие опухоли).

3. Экспрессия отдельных генов Т-ДНК. Инфекционный процесс начинается с прикрепления

A. tumefaciens к клеткам растения в месте повреждения, чаще всего у основания стебля. Поврежденное растение выделяет специфические фенольные соединения, которые активируют гены вирулентности (vir-гены), локализованные в участке Ti-плазмиды за пределами Т-ДНК .

Продукты vir-генов необходимы для транспорта и интеграции Т-ДНК в геном растительной клетки. После активации fir-генов Т-ДНК транспортируется в клетку. При этом она находится в одноцепочечной форме, и именно в такой форме происходит ее встраивание в хромосомную ДНК растения.

Генетическая карта 77-плазмиды (масштаб не соблюден). Т-ДНК содержит гены ауксина, цитокинина и опина, которые транскрибируются и транслируются только в растительных клетках За пределами Т-ДНК находится кластер vir генов гены кодирующие ферменты катаболизма опина, и сайт инициации репликации (ori), который обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в A. tumefaciens Л и П — левая и правая фланкирующие последовательности соответственно

Большинство генов Т-ДНК активируются только после ее интеграции в хромосомную ДНК растения. Их продукты и вызывают образование корончатого галла. Это происходит в результате экспрессии плазмидных генов, кодирующих ферменты, обеспечивающие синтез растительных гормонов ауксина (ИУК — индолилуксусная кислота) и цитокининов. Ауксин и цитокинины регулируют рост и

развитие растительной клетки, но, присутствуя в избытке, могут вызывать у растений образование опухолей.

При использовании 77-плазмиды в качестве вектора для генетической трансформации растений кассету экспрессии, содержащую целевой ген, встраивают в Т-ДНК, а затем такой модифицированной плазмидой, помещенной в бактерию A. tumefaciens, инфицируют клетки растений.

Несмотря на то что 77-плазмиды являются эффективными природными векторами, их использование имеет некоторые ограничения. Наиболее существенные из них следующие:

1. Ауксин и цитокинины, синтезируемые трансформированными 77-плазмидами клетками, подавляют регенерацию зрелых растений из этих клеток. Следовательно, при конструировании векторов на основе 77-плазмид гены ауксина и цитокинина должны быть удалены.

2. Ti-плазмиды имеют очень большой размер (200— 800 тыс. нуклеотидных пар), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера. Следовательно, участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.

3. 77-плазмиды не реплицируются в кишечной бактерии Escherichia coli (именно в этих бактериях производят клонирование созданного вектора для получения множества его копий, которые в дальнейшем и будут использовать для трансформации растительных клеток). Следовательно, при конструировании векторов необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их воспроизводство в Е. coli.

Кроме манипуляций,, связанных с удалением из 77-плазмид определенных участков ДНК и введения в них сайта инициации репликации кишечной бактерии, в вектор включают специальный ген, который позволяет идентифицировать трансформированные клетки. Он дает возможность обнаружить клетки растений, несущие чужеродную ДНК в составе геномной ДНК трансформиро

ванного растения. Эти гены позволяют либо проводить отбор трансформированных клеток — в этом случае они называются селективными маркерными генами, либо оценивать активность кодируемого ими фермента — регуля-торные гены. Испытано несколько десятков генов, которые можно использовать как селективные маркерные гены, и репортерных генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специальных методов .

Как правило, в качестве репортерных используют бактериальный плазмидный ген фермента, который обеспе-

Системы репортерных и селективных маркерных генов растительных клеток

чивает устойчивость трансформированных растительных клеток к тому или иному антибиотику. Чаще всего это ген неомицинфосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к канамицину. В качестве селективных маркерных генов используют гены, которые кодируют ферменты, обеспечивающие устойчивость растительных клеток к антибиотикам или гербицидам. Так, в присутствии ка-намицина выживают только те клетки, которые синтезируют активную неомицинфосфотрансферазу. Поскольку этот ген бактериальный (прокариотический) и не может экспрессироваться в растениях, его ставят под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и терминатора. Это обеспечивает эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках. Однако следует отметить, что, по мнению экспертов-биотехнологов, присутствие некоторых генов и их продуктов может приводить к загрязнению коммерческого продукта. В связи с этим лучше не вводить гены устойчивости к антибиотикам в сельскохозяйственные растения.

Читайте:  Какие вещества регулируют рост растений биология 6 класс

Таким образом, осуществив всё необходимые модификации Ti-плазмид, получают вектор, пригодный для трансформации клеток растений.

Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и кроме кассеты экспрессии содержат следующие элементы:

♦ селективный маркерный ген, который обеспечивает устойчивость трансформированных клеток к антибиотикам;

♦ сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens; .

♦ правая фланкирующая последовательность Т-ДНК, которая абсолютно необходима для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений;

♦ полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

Так как клонирующие векторы не содержат uir-генов, то они сами не могут проникать в клетки растения и интегрироваться в их геном. Существуют два способа решения этой проблемы.

В первом случае используют бинарную векторную систему. Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации (ori) и для Е. сой и для A. tumefaciens, но не несет u/r-генов. Все стадии клонирования проводят в E.coli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens, которая несет модифицированную неонко-генную 77-плазмиду. 77-плазмида содержит vir-гены, но из нее удалена Т-ДНК. Таким образом, бактерия не может транспортироваться в клетку растения, но может обеспечить синтез продуктов vir-генов, которые способствуют встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения. То есть, она выполняет роль помощника интеграции Т-ДНК в геном растительной клетки.

Во втором случае используют коинтегративную векторную систему. Коинтегративный клонирующий вектор, несущий нужный ген, содержит сайт инициации репликации (ori) только для Е. coli и не может автономно существовать в A. tumefaciens. Он также несет бактериальный селективный маркерный ген, правую фланкирующую последовательность Т-ДНК (П), без которой невозможна интеграция в чужой геном, и фрагмент 77-плазмиды, гомологичный участку Т-ДНК неонкоген-ной 77-плазмиды. Неонкогенная 77-плазмида содержит левую фланкирующую последовательность (JI), vir-гены и сайт инициации репликации A. tumefaciens (ori). После рекомбинации коинтегративного клонирующего вектора и неонкогенной 77-плазмиды образуется рекомбинантная плазмида, Т-ДНК которой, несущая клонированный ген, может трансформировать клетки растений.

После накопления клонирующих векторов в Е. coli в нужном количестве и их выделения из этих бактерий возможно использование рекомбинантных ДНК для трансформации растительных клеток.

Две векторные системы на основе Ti-плазмид.

А — бинарный, Б — коинтегративный векторы Пояснения в тексте

Две векторные системы на основе Ti-плазмид.

А — бинарный, Б — коинтегративный векторы Пояснения в тексте

Трансформация растительных клеток. Для трансформации растительных клеток был разработан ряд методов: использование Ti-плазмид, бомбардировка микрочастицами, использование векторов на основе вирусов, микроинъекции, электропорация и др. .

Методы введения ДНК в клетки растений

Эффективность применения и перспективы использования

Высокоэффективная система. Применима не для всех видов растений

Высокоэффективная система. Может использоваться для широкого круга растений и тканей

Использование векторов на основе вирусов

Неэффективный способ доставки ДНК в растительные клетки

Применение ограничивается тем, что инъекция одновременно может быть сделана только в одну клетку

Применение возможно для введения генов только в протопласты, причем растений тех видов, из протопластов которых могут быть регенерированы жизнеспособные растения

Прямое введение генов в протопласты

Как указывалось выше, такими способами были трансформированы более 50 различных видов растений. Однако в настоящее время для производства трансгенных культур в промышленных масштабах в основном применяют агробактериальный (с помощью Тi-плазмид) и баллистический (бомбардировка микрочастицами) способы модификации растительного генома.

Использование агробактерий, содержащих клонирующий вектор, — достаточно высокоэффективная система, несмотря на то, что частота трансформации составляет 1 из 10 000 растительных клеток. Кроме того, как уже отмечалось, они могут быть применены только для переноса генов в двудольные растения, Однодольные растения, включая основные зерновые культуры (рис, пшеница, кукуруза), практически не трансформируются A. tumefaciens. Поэтому для трансформации клеток однодольных чаще всего применяют баллистический способ. Для бомбардировки используют золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,5—2 мкм, покрытые ре-комбинантной ДНК. Этим частицам посредством электрического разряда или сжатым газом придается скорость 300—600 м/с, в результате чего они пробивают клеточную стенку и клеточную мембрану. Попав в клетку, рекомби-нантная ДНК интегрируется в растительную ДНК. Эффективность метода очень высокая — до 15%. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в том числе однодольные и хвойные. Ниже указаны трансгенные растения, полученные баллистическим способом:

Источник

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ

Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют «трансгенами») из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются: возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип; возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами; значительное ускорение процесса получения новых генотипов.

Наиболее широко используемый метод трансформации — агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли — корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку.

Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.

Признаки, которые возможно придать с помощью генной инженерии, весьма разнообразны и в основном ограничены только наличием соответствующих генов. Очень условно их можно разделить на три группы. К первой относятся признаки, интересные производителям: устойчивость к различным факторам окружающей среды — гербицидам, болезням, вредителям, засухе, засолению, улучшение минерального питания, повышение укореняемости. Вторая группа признаков представляет интерес непосредственно для потребителей — модификация вкуса и аромата плодов, увеличение продолжительности их хранения, изменение окраски цветков, бессемянность, улучшение питательной ценности растений. В третью группу входят растения-«биофабрики», способные синтезировать вакцины, ферменты, биополимеры и другие полезные вещества.

Читайте:  Ошибка 6 Не различать Омега 3 и Омега 6

ДНК бактерий существуют не только в виде хромосом, но и в виде маленьких кольцевых молекул (плазмид). Бактерии Agrobacterium tumefaciens помимо прочих содержат плазмиды, вызывающие опухоли (Ti-плазмиды). На такой плазмиде среди прочих генов имеется так называемая область Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухоли на растениях и синтез опинов. Именно этот кусочек плазмиды агробактерии встраивают в ДНК растений. Выяснилось, что агробактерии в принципе способны переносить в растения любую ДНК, которая расположена в этом месте плазмиды. Поэтому в плазмидах, используемых в генно-инженерных целях, природные гены заменяют любыми другими, представляющими интерес для человека. Как правило, это два-три гена: целевой, который придает, например, устойчивость к насекомым; селективный, который придает устойчивость к определенным веществам (чаще всего — антибиотикам), что позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как нетрансформированные клетки в ней гибнут; и иногда — репортерный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например, по окрашиванию или свечению в ультрафиолетов ом свете.

В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты), из которых проще всего регенерировать целые растения (чаще всего используются листья). Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерии с помощью vir-белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в растительную ДНК.

Затем растительную ткань помещают на питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерии перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам, то есть трансформированные. Условия и состав среды подобраны таким образом, что трансформированные клетки активно размножаются, образуя неорганизованную массу делящихся клеток (калллус), из которой регенерируют трансгенные растения. Полученные растения размножают и подвергают различным анализам сначала в пробирке, а потом — на полях и в теплицах.

Создание одного нового сорта ГМР стоит от 50 до 300 млн долларов и занимает от 6 до 12 лет.

Источник

Генетическая трансформация растений бактериями рода

Раздел 1. Получение и применения трансгенных растений

При изучении данного раздела курса студент должен обратить внимание на феномен генетической колонизации растений бактериями рода A g ro b acterium. Также необходимо уметьдатьс труктурное и функциональное сравнение Т-ДНК плазмид октопинового и ноналинового типов. Изучить принцип конструирования и характеристику промежуточных (коинтегративных) векторов на основе Ті — плазмид. В данном пособии содержится материал по данным темам с рисунками 1-3 для более глубокого понимания.

В этом разделе студенту также необходимо освоить методы введения генетической информации в растения с помощью агробактерий, и возможности использования вирусов растений для создания векторных систем. Изучить такие методы как: трансформация, кокультивация, биобаллистика, электропорация, микроинъекций.

Растения обладают таким важным свойством, как тотипотентность, которое раскрывает для молекулярных биологов большие возможности по созданию трансгенных растений. Основной целью биотехнологических экспериментов на растениях является создание новых высокоурожайных сортов культурных растений без изменения их пищевой ценности. Исследования в этой области также направлены на обеспечение устойчивости растений к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам, неблагоприятным условиям окружающей среды.

Феномен генетической колонизации растений бактериями рода A g ro b acterium

Agrobacterium tumefaciens вызывает образование опухолей у двудольных растений. Способность A. tumefaciens индуцировать у растений образование опухолей типа «корончатого галла» коррелирует с наличием у них Ti-плазмиды. Опухолевая трансформация проявляется в гипертрофии возникающей после проникновения агробактерий в пораненные участки растений (рисунок 1). Трансформация является результатом включения сегмента («transferred» или Т-ДНК) плазмиды (pTi — tumor inducing или pRi — root inducing) бактерий в ядерную ДНК растительной клетки.

1 — агробактерии существуют в ризосфере;

2 — строение A. tumefaciens;

3 — встраивание Т-ДНК в геном;

4 — образование опухоли.

Рисунок 1 – Генетическая колонизация растения A. tumefaciens

Структурное сравнение Т-ДНК плазмид октопинового и ноналинового типов

В ходе исследований выявлено наследуемое изменение в клетках корончатых галлов — это синтез опинов. Необычное для растений соединение, производное аргинина, обнаруженное лишь в определенных опухолевых линиях, было названо октопином. Затем было показано, что другими опухолевыми линиями синтезируется еще одно соединение — нопалин, также производное аргинина. В зависимости от типа индуцируемого в опухоли опина штаммы A. tumefaciens и находящиеся в них Ti-плазмиды получили соответствующее обозначение — октопиновые или нопалиновые.

В результате исследований обнаружено четыре основных области гомологии между октопиновой и нопалиновой плазмидами. Две консервативные области (А и D) вовлечены в онкогенность, еще одна (В) соответствует области контроля репликации плазмиды, в то время как последняя (С) кодирует функции конъюгативного переноса (рисунок 2). Кроме Т-ДНК в плазмидах имеется область, кодирующая функцию конъюгации (Tra), а также область репликации (Ori V) и область вирулентности (Vir).

Рисунок 2 – Структура Тi-плазмид нопалинового и октопинового типа

Принцип конструирования и характеристика промежуточных (коинтегративных) векторов на основе Ті- плазмид

Метод «промежуточных векторов » (коинтегративных векторов) служит для введения Ti-плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, в растение. Данный метод основан на использовании плазмиды кишечной палочки pBR 322 (рисунок 3).

Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду.

Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.

Рисунок 3 – Создание коинтегративного вектора на основе Тi-плазмиды

Вопросы для управляемой самостоятельной работы:

1. Получение трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, насекомым-вредителям, вирусам, стрессовым воздействиям, с измененным цветом лепестков цветка.

2. Перспективы создания трансгенных растений, устойчивых к бактериальным и грибковым заболеваниям, с улучшенными пищевыми качествами, товарным видом, пригодных для получения вакцин и сывороток из растительного материала.

3. Возможности использования трансгенных растений и качестве источников сырья для парфюмерной, химической и текстильной промышленности.

Вопросы для самоконтроля:

1. Что подразумевается под термином генетическая колонизация?

2. Какая бактерия несет инфекционный фактор, приводящий к болезни «корончатый галл»? Охарактеризуйте заболевание.

3. Какие практические задачи выполняют плазмиды бактерий?

4. Как осуществляется перенос гипотетического гена с помощью Ti-плазмиды?

6. Какие требования предъявляются к векторной молекуле?

7. Какие недостатки Ti – плазмид?

8. Охарактеризуйте коинтегративный клонирующий вектор.

9. Дайте определение понятию бинарный вектор.

10. Благодаря каким особенностям вироиды рассматриваются в качестве потенциальных векторов?

Источник



Генетическая трансформация растений. Трансформация растений с помощью агробактерий

Одной из основных проблем при получении трансгенных растений был способ введения чужеродных генов в хромосомы растений, т.е. трансформация растительных клеток. Значительный прорыв был сделан при открытии возможности использования природной системы трансформации растений Тi-плазмидами почвенных агробактерий.

Читайте:  Зеленогорский питомник растений

Ранее было известно, что некоторые виды почвенных бактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения и вызывать при этом образование специфических опухолей-корончатых галлов. Опухоли состоят из недифференцированных клеток, интенсивно делящихся и растущих в месте заражения. При культивировании in vitro клетки опухоли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для роста нормальных растительных клеток. Если после заражения все агробактерии инактивировать добавлением антибиотика, то клетки корончатых галлов сохраняют способность к неконтролируемому делению. Итак, присутствие агробактерий необходимо только для индицирования образования опухоли. Опухолевые клетки начинают синтезировать необычные для растения аминокислоты-опины (производные аргинина), которые используются агробактериями в качестве источника азота и углерода. Таким образом, при заражении растения агробактерий происходит перестройка метаболизма трансформированных растительных клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий.

Тi –плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК длиной ≈ 200 т.н.п. В бактериальных клетках они способны реплицироваться автономно. Тi –плазмиды могут быть разделены на четыре группы по типу синтезируемых ими опинов. Чаще всего встречаются тi –плазмиды , кодирующие аминокислоты нопалин или октопин. Причем агробактериальная клетка может содержать только один тип плазмиды: либо октопиновую, либо нопалиновую.

Генетические исследования показали, что Тi- плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательности, которые можно поделить на две группы: 1). Необходимые для метаболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка начала репликации плазмиды и т.д ) 2). Необходимые для трансформации растительной клетки. При этом следует особо отметить, что гены первой группы имеют прокариотический тип промотора и могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй группы могут работать в растительной клетке. Ко второй группе относятся гены, ответственные за индукцию опухоли и синтез опинов.

Трансформация растения в результате агробактериального заражения происходит следующим образом. Было показано, что агробактерия не входит в растительную клетку, не входит в нее и Тi-плазмида, но часть Тi-плазмиды переносятся в ядро растительной клетки и может встраиваться в растительный геном. Этот фрагмент Тi- плазмиды был назван Т-ДНК (от англ. Transforming DNA- трансформирующая ДНК). На концах Т-ДНК находятся прямые повторы (25н.п), которые необходимы для вырезания ее из состава плазмиды и интеграции в геном растений. Область Т-ДНК несет семь генов: ген, кодирующий синтез одного из опинов, а также шесть генов, кодирующих признаки опухолеобразования, причем два из них кодируют синтез ауксина, а один- синтез цитокинина. В результате экспрессии этих генов в трансформированных клетках меняется гормональный статус, что приводит к их дифференцировке и опухолеобразованию.

Процесс трансформации растения начинается с того, что агробактерии прикрепляется к растительной клетке в области поражения последней. При поранении растительная клетка выделяет во внешнюю среду специфическое фенольное соединение -ацетосиренгон. Итак, методы в то или ином сочетании позволяют получить многие гены, продукты которых- белки- известны и могут быть выделены хотя бы в малом количестве. Эти гены в дальнейшем могут стать объектом генно- инженерных манипуляций, задача которых получить их экспрессию в новом генетическом окружении.

5. Источники генов для улучшения растений

Генетический код един для всех живых существ. Круг источников генов, которые могут быть использованы для улучшения свойств культурных растений, не органичен миром растений. Гены, выделенные из различных царств, семейств и отрядов живых организмов могут работать в представителях любых других царств, семейств и отрядов.

Например, ген белка GFP, выделенный из морской медузы и светящийся в ультрафиолете, успешно работает в трансгенных растениях, помогая отслеживать процесс трансформации и селекции. Гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам, выделенные из микроорганизмов, служат маркерами трансформации в растениях.

Существенно удешевили получение урожая гены устойчивости к гербицидам и насекомым. Известно, что для борьбы с сорными растениями, конкурирующими с культурными, требуются значительные средства. Если иметь культуры, устойчивые к гербицидам, последними можно обрабатывать посевы, и уничтожать сорняки без вреда для культурных растений.

Ген bar, выделенный из бактерии, определяющий устойчивость к гербициду «Баста», был введен и апробирован на ряде важнейших культур, в том числе на злаках и сахарной свекле.

В течение нескольких десятилетий для борьбы с насекомыми использовалась культура бактерий Bacillus thuringiensis (Bt). После обработки этой культурой растения не подвергались атакам насекомым. Оказалось, что действенным началом бактерии являются токсичные для насекомых белки, препятствующие всасыванию пищи.

В таблице 1 представлены данные об источниках генов устойчивости к насекомым-вредителям. Трансгенный картофель с генами Bt показал надежно наследуемую устойчивость к колорадскому жуку и получил широкое распространение в странах, страдающих от этого насекомого. С 1997 года во Франции проводятся испытания трансгенной Bt-кукурузы, устойчивой к стеблевому мотыльку.

Таблица 1. Источники генов токсинов из Bt, защищающие растения от насекомых-вредителей.

Разновидности Bt. Вредители, чувствительные к токсину
Var.tenebrionis u san diego Колорадский жук, личинки вязового листоеда
Var. kurstaki Гусеницы капустницы, мешочницы, озимой совки, капустной моли, и др. чешукрылых, личинки европейского кукурузного сверлильщика
Var. ismelensis Личинки и имаго многих двукрылых
Var. aizavai Личинки воскового мотылька (вредитель в пчеловодстве), капустного мотылька и др.

Полевые испытания трансгенного картофеля, созданного в лаборатории генетической инженерии растений Центра «Биоинженерия» РАН, показали сохранность признака устойчивости к колорадскому жуку в течение не менее трех вегетативных поколений.

6. Безопасность генетически модифицированных растений

Создание ГМР — высоко технологический процесс, основанный на фундаментальных научных знаниях, требующий высококвалифицированных кадров и мощной современной инструментальной базы. Трансгенное растение создается в научных лабораториях, проходит стадию испытаний в теплицах и в полевых условиях, затем государственные сортоиспытания, регистрацию и, наконец, выходит на рынок: для выращивания в окружающей среде; употребления в пищу непосредственно или в переработанном виде; в качестве кормов для животных, или как источник лекарств-«съедобных» вакцин.

Стратегия биобезопасности основывается на научном исследовании особенностей ГМР, опыте обращения с ними, а также информации о его предполагаемом использовании и окружающей среде, в которую ГМР будет интродуцировано. Совместными многолетними усилиями международных организаций (ЮНЕП), экспертов из разных стран, в т.ч. России, были разработаны базовые понятия и процедуры:

«Опасность» — потенциальная возможность ГМР причинить вред здоровью людей или окружающей среде.

«Риск»- вероятность реализации опасности, если она определена, при высвобождении ГМР в потенциальную принимающую среду. Очень важно определить, в чем фактически состоят риски. При этом учитываются два особых фактора: последствие конкретного события и вероятность наступления события.

«Оценка рисков»- меры по оценке того, какой вред может причинен, как он может проявиться и какими могут быть масштабы предполагаемого ущерба. Оценка рисков должна проводится строго на научной основе, при этом каждое новое ГМР рассматривается индивидуально, поэтапно и в сравнении с исходным не модифицированным растением. Международными и российскими правилами требуется применение «принципа предосторожности» в тех случаях, когда полная информация отсутствует.

Как обеспечивается биобезопасность в России? Началом включения России в мировую систему биобезопасности можно считать ратификацию страной «Конвенции о биобезопасности» в 1995г. С этого момента началось формирование национальной системы биобезопасности (НСБ) как части системы национальной безопасности страны, при этом учитывались международные рекомендации.

Источник